1. Cel prowadzonych badań/hipoteza badawcza W Gdańskim Uniwersytecie Medycznym od 2000 roku prowadzone są badania molekularne mające na celu identyfikację mutacji w genach LDLR, APOB i PCSK9 u pacjentów z hipercholesterolemią rodzinną (FH). Dotychczas analizę molekularną, również przy użyciu techniki sekwencjonowania kolejnej generacji (NGS), wykonano u około 1500 probantów oraz członków ich rodzin co pozwoliło na stworzenie Krajowego Centrum Diagnostyki i Leczenia Hipercholesterolemii Rodzinnej (KCDiLHR). Celem niniejszego projektu jest: a) analiza ekspresji i aktywności wybranych 20 wariantów genetycznych genu LDLR przy użyciu badań in vitro, a także porównanie uzyskanych wyników z danymi klinicznymi pacjentów, b) poszukiwanie patogennych wariantów genetycznych w obrębie sekwencji kodującej genu APOB, STAP1 oraz LDLRAP1 przy użyciu techniki NGS.

2. Zastosowana metoda badawcza/metodyka a) badania in vitro genu LDLR Gen LDLR oraz jego badane warianty zostaną wprowadzone do komórek HepG2 za pomocą odpowiednio skonstruowanych wektorów ekspresyjnych. Do C-końca badanych białek zostanie dołączony znacznik HA co pozwoli na wykrycie w komórce białka fuzyjnego LDLR-HA przy użyciu specyficznych przeciwciał. Następnie, przy wykorzystaniu metody Western-blotting, zostanie określona ilość badanych wariantów białka LDLR w komórce w porównaniu do dzikiego typu białka. Przeprowadzone zastaną również badania mające na celu oznaczenie ilości białka LDLR we frakcjach białek cytoplazmatycznych i błonowych, a także badania z zastosowaniem technik immunoflourescencji z użyciem mikroskopu konfokalnego celem określenia lokalizacji badanych wariantów w komórkach. Przeprowadzone zostaną także badania wydajności wiązania LDL przez badane warianty LDLR z użyciem fluorescencyjnie znakowanego LDL i technik cytometrii przepływowej. b) analiza molekularna sekwencji kodującej genu APOB, STAP1 oraz LDLRAP1 Do badań zostanie wykorzystane DNA od 200 pacjentów KCDiLHR, u których nie stwierdzono obecności mutacji w genach LDLR, PCSK9 oraz fragmencie eksonu 26 genu APOB. Badanie zostanie wykonane przy użyciu zestawu TruSeq Custom Amplicon oraz urządzenia MiSeq. Do analizy danych zostanie wykorzystane oprogramowanie Illumina Variant Studio oraz Geneious R9. Obecność ewentualnych mutacji zostanie potwierdzona przy użyciu sekwencjonowania metodą Sangera.

3. Wpływ spodziewanych rezultatów na rozwój nauki, cywilizacji, społeczeństwa Dotychczas opisano ponad 1700 różnych mutacji genu LDLR, które prowadzą do FH. Obecność mutacji zaburza budowę i/lub funkcję receptorów LDL. W zależności od efektu fenotypowego, jaki wywierają na białko mutacje genu LDLR można podzielić na pięć głównych klas. Badania in vitro pozwolą na stwierdzenie, czy różnice obserwowane na poziomie DNA pociągają za sobą istotne zmiany w budowie lub aktywności receptora LDL. W przeciwieństwie do licznych mutacji genu LDLR, dotychczas opisano nieliczne mutacje genu APOB głównie zlokalizowane w obrębie kodonu R3500 w eksonie 26 genu APOB. Wyniki ostatnich badań wykazały obecność mutacji w innych eksonach genu APOB. Wykorzystanie techniki NGS i analiza całej sekwencji kodującej genu APOB pozwoli na ewentualną identyfikację nowych wariantów genetycznych odpowiedzialnych za FH. Wyniki ostatnio opublikowanych badań, wykazały obecność mutacji genu STAP1 u pacjentów z FH. Do dnia dzisiejszego mutacje tego genu opisano zaledwie u kilkunastu probantów z FH w Holandii i Niemczech. W zdecydowanej większości przypadków FH dziedziczona jest w sposób autosomalny dominujący. Jednakże w literaturze opisano również przypadki hipercholesterolemii rodzinnej dziedziczonej w sposób autosomalny recesywny (ARH). Jak dotąd mutacje prowadzące do ARH opisano wyłącznie w genie LDLRAP1. Reasumując, przeprowadzenie powyższych badań pozwoli nie tylko na pogłębienie wiedzy na temat patomechanizmu molekularnego FH, ale również może mieć wpływ na modyfikację algorytmu diagnostycznego oraz poradnictwa genetycznego oferowanego pacjentom z FH oraz członkom ich rodzin. Prawidłowa diagnostyka i odpowiednia profilaktyka w znacznym stopniu uchroni członków tych rodzin przed klinicznymi konsekwencjami tej choroby.